Произведение, во многом необычное с точки зрения иконографической традиции и художественного решения, теснейшим образом связано с творчеством Леонардо да Винчи.  На фоне пейзажа с ясными далями изображена Мадонна с младенцем Христом и маленьким Иоанном Крестителем. Сюжет наполнен глубоким трагическим смыслом: Христос сжимает в правой руке щегла — символ смерти, а Иоанн Креститель обнимает агнца — символ жертвенной миссии Христа.

Центр композиции занимает коленопреклоненная Мадонна: как правило в такой позе она изображалась лишь в сценах Рождества и Поклонения Младенцу, но можно предположить, что автор картины хотел подчеркнуть роль Богоматери как защитницы и покровительницы, показать ее как воплощение божественного милосердия. Именно в такой позе ее фигура неоднократно повторяется в работах и самого Леонардо, в том числе в знаменитой картине «Мадонна в гроте» из собрания Лувра: её рентгенографическое исследование показало, что по первоначальному замыслу художника Мадонна изображалась в той же позе, что и на картине «Мадонна с двумя играющими младенцами». 

Также существует группа рисунков Леонардо да Винчи, к которым восходят отдельные фрагменты композиции, в частности - изображения младенцев. Прямое отношение к картине, представленной в Пушкинском музее в рамках проекта, имеет рисунок из Музея Гетти (Лос-Анджелес), в котором трижды повторен сидящий младенец, обнимающий за шею ягненка. Набросок фигуры младенца с ягненком есть и в Королевской коллекции (Виндзор). Этот мотив встречается и в живописных работах самого мастера и его учеников.

Существует также несколько известных вариантов композиции с коленопреклоненной Мадонной и двумя младенцами. Одна близкая композиция, неоконченная и в плохом состоянии сохранности, находится в Музее Ашмола в Оксфорде. Другая картина - из собрания Палатинской галереи в палаццо Питти (Флоренция) - привлекла наибольшее внимание исследователей еще в конце XIX века, а в 1920-е годы авторство этой работы стало предметом научных споров. Известны произведения, которые отличаются не только деталями, колористическим решением, но качеством и манерой исполнения, что указывает на авторство разных учеников из мастерской Леонардо да Винчи.